能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。
分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统。
一、光源
要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯（钨比灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。
钨灯和卤钨灯发射320－2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360－1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150－400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。红外线光源则由纳恩斯特（Nernst）棒产生，此棒由ZrO2:Y2O3=17:3（Zr为锆，Y为钇）或Y2O3，GeO2（Ge为铈）及ThO2
（Th为钍）之混合物制成。汞灯发射的不是连续光谱， 能量绝大部分集中在253.6nm波长外，一般作波长校正用。钨灯在出现灯管发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要调节灯座的位置的焦距。氢粘及氘灯的灯管或窗口是石英的，且有固定的发射方向，安装时必须仔细校正接触灯管时应戴手套以防留下污迹。
二、分光系统（单色器）
单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石棱镜工作波长范围为185￣4000nm，在紫外区有较好的分辩力而且也适用于可见光区和近红外区。 棱镜的特点是波长越短，色散程度越好，越向长波一侧越差。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到0.2nm，而在长波段只能达到5nm。有的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光，于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。
三、狭缝
狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。狭缝可在0－2mm宽度内调节，由于棱镜色散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。
四、比色环
比色环也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。
五、检测器系统
有许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电流愈大，此即光电效应。因光照射而产生的电流叫做光电流。受光器有两种，一是光电池，二是光电管。光电池的组成种类繁多，最常见的是硒光电池。光电池受光照射产生的电流颇大，可直接用微电流计量出。但是，当连续照射一段时间会产生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一些时候才能恢复。因此使用时不宜长期照射，随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。
光电管装有一个阴极和一个阳极，阴极是用对光敏感的金属（多为碱土金属的氧化物）做成，当光射到阴极且达到一定能量时，金属原子中电子发射出来。光愈强，光波的振幅愈大，电子放出愈多。电子是带负电的，被吸引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，需要放大。分光光度计中常用电子倍增光电管，在光照射下所产生的电流比其他光电管要大得多，这就提高了测定的灵敏度。
检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟/数字转换装置如数字式电压表等。
、开启电源，将转换开关打到透光档，打开样品室的盖板，如果显示显示不到零，用调零电位器调不到零位时，可从下列几方面去检查：开启电源后，先检查钨灯电压是否正常（应在11.5＋0.5V），若正常则取下长方形盖板，检查仪器左侧的一直粗调零位电位器，它顺时针旋转时指示变大，逆时针旋转时则相反，看看这样能否调到零位。第三步检查仪器内部联接线是否有脱落、虚焊和接触不良等现象（包括检查七芯插座、插头等）。第四步检查放大器是否受潮，严重受潮时会影响零位调节。为了较快驱除潮气，可用电热吹风机向光电管暗盒内吹入热风，但需注意不要太烫，因硅胶筒座是塑料的，温度太高容易软化。此外，微电流放大器有故障或光电管损坏也会导致调不到零位。此时，可拆下暗盒，将光电管的二股引线焊去，单是放大器。
电源开启后，光源灯亮，调零电位器正常，但发现样品室无单色光通过，这时，可打开钨灯盖板，直接观察光源灯位置是否良好。稍松一下两只紧固螺丝，在通光孔处插入一白纸片，调节灯座部件，同时观察插入通光孔处的白纸片上有无光斑出现。若有，先调光斑至最清晰最完整，然后紧螺丝。如紧螺丝后光斑略有变化，则可稍微旋动灯架，使光斑达到最好的程度。若虽经细心调整但仍无光斑出现时，则要检查单色器的光路。将仪器横行竖放，拆下单色器盖板，就可看到单色器内部结构。在单色器进口狭缝处，应有光亮射入，可移动光源灯泡及灯座位置，使进光最亮。然后，用一白纸片随着光斑向准直镜方向移动，使光斑落在准直径的中央稍下处，如偏左或偏右，可调光学系统（光斑上下方向调节是依靠调小反射镜的倾斜角来实现的）使之位置正好合适。
准直镜的平行棱镜色散后又反射至准直镜面，准直镜则将色散的光聚焦在出光狭缝上，此时可观察到一条明亮的光谱带，则必有单色光从出光狭缝射出，在实样室就有单色光射到光电管上。如果光谱带不在出光狭缝处，太高、太低、太左、太右都不能从出光狭缝射出单色光，这时应调节准直镜的三只螺钉。如波长度数盘放在580nm，则在出光狭缝处应位**，调节范围一般很小；若变化很大，便可能是此部件或螺钉松脱了，可将螺钉紧固后再进行调整。
3、开启电源，指示灯亮，但光源不亮。这时，首先检查钨灯稳压电源是否插在插座上，检查电源变压器17V有无输出，灯泡灯丝是否已断。再将100％旋钮顺时针旋到底，检查灯的两极电压是否在11.5＋0.4V左右。如无11.5V输出电压，就要按一般规律去检查整流管，在此以后，检查电容器直流电压是否在20V左右，然后检查稳压印刷板电路是否有脱落、虚焊或元件是否有损坏，再检查一下各联接线焊点，最后检查稳压电源。
4、如各调节旋钮可以工作，但显示值左右摆动、不稳定。这可能是因为光源不稳定、漏光、受潮、结构松动等或微电流放大器性能变坏和光电管损坏所致。
这时，首先可检查输出电压的（11.5V）的稳定性，同时检查输入的交流电压是否在190～240V的正常范围内。可用数字电压表进行测量，输出电压的变化要小于0.004V，输出电压输出是否有跳动现象。
其次用黑布逐处遮住仪器右侧，测试光电管暗盒等部分，观察透光度指示有无变化，检查是否有漏光部位；再把仪器放在平整的工作台上，使底部平稳，在没有外力作用下，观察显示是否稳定。
最后，调节仪器零位。灵敏度从1挡到3挡，若发现零位指示偏移很大，则要调换失效的硅胶，使暗盒保持干燥。此外，微电流放大器中3DJ6F（BG12）场效应管人RGS性能变坏、阻抗降低时也会产生抖动现象，这时需更换RGS大于1011Ω的3DJ6F场效应管。
另外，可在未装光电管时观察放大器有无抖动。如果光电管受光照射，指示就会不稳，那么在光源等都良好的情况下，说明光电管有毛病，应予以更换。
5、在使用灵敏度1挡时，顺时针调节100％旋钮到最大，但仍不能调到100%（E＝0）处。此时可将灵敏度转到2挡，如仍调不到100％，可改用3挡，仍不能则需按前面所述调节光路。
3、在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
4、将仪器电源开通，打开比色皿暗箱盖，选择需用的单交波长，灵敏度选择请参照“5”调节“0”电位器使用电表指“0”；然后将比色皿暗箱盖合上，比色皿座处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，旋转调“100%”电位器，使电表指针到满度附近，仪器预热20分钟。
5、放大器灵敏度有五档，是逐步增加的，“1”最低。其选择原则是保证能使空白档良好调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置“1”，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后需按“4”重新校正“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。
6、预热后，按“4”连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。
7、如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后稍等片刻，当指针稳定后，重新调整“0”和“100%”即可工作。
上述操作规程请充分注意，这样仪器可获得满意的测试结果。
721型分光光度计其波长范围360——800nm，色散元件为三角棱形
操作方法：
（1）仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
（2）仪器的电源开关接通（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，使电表指针处于“0”位，预热20分钟后，再选择需用的单色光波长和相应的放大灵敏度档，用调零电位器校正电表“0”位。
（3）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽座处于蒸馏水校正位子，使光电管见光，旋转光量调节器调节光电管输出的光电讯号使电表指针正确处于100%。
（4）按上述方式连续几次调正“0”位和电表指针100%，仪器即可进行测定工作。
（5）放大器灵敏度档的选择是根据不同的单色光波长，光能量不一致时分别选用，其各档的灵敏度范围是：
第一档×1倍 第二档×10倍 第三档×20倍
选用的原则是能使空白档良好的用光量调节器调整于100%处。
（6）空白档可以采用空气空白，蒸馏水空白或其他有色溶液中性吸光玻璃作陪衬。空白调节于100%处，能提高吸光度数以适应溶液的高含量测定。
（7）根据溶液中的被测物含量的不同可以酌情选用不同规格光程长度的比色槽，目的是使电表读数处于0.8消光之内。
1）预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。
2）选定波长。根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。
3）固定灵敏度档。根据有色溶液对光的吸收情况，为使吸光度读数为0.2-0.7，选择合适的灵敏度。为此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在“1”档。
4）调节“0”点。轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。
5）调节T=100％。将盛蒸馏水（或空白溶液或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调节器，使透光度T=100％，即表头指针恰好指在T=100％处。
6）测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。
7）关机。实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。
注意事项：
1）为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。
2）比色皿的使用方法：
①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。
②清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1∶2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。
每次做完实验时，应立即洗净比色皿。
③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。
④测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。
⑤在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。
