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用台盼蓝染色,死细胞会被染成蓝色,而活细胞不着色,从而判断细胞死活

死细胞的鉴别一般通过DNA结合染料排除,利用死细胞膜通透性增大、不破膜的情况下DNA染料即可进入的特点区分出死细胞,但所用染料浓度、时间远远低于细胞周期所用的浓度,并且不需要固定。

常用的核酸结合死活鉴别染料包括:

碘化丙啶(propidium iodide,PI)

4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)

7-氨基 - 放线菌素D(7-amino-actinomycin D ,7-AAD)

DRAQ7

SYTOX

不过对于一些胞内抗原(细胞因子、转录因子),由于需要固定、破膜,所以上述染料中,除了一些胺类染料(如Live/Dead、Ghost等)和新型蒽醌类染料CyTRAK Orange外,其它染料不再适合此类标本的细胞死活鉴别。

这里,只向大家讲解一下用PI、7-AAD、DAPI的染色方法,其它商品化死活染料请按照说明书操作:

1. 用0.5ml 1×PBS重悬细胞。

2. 加入PI或DAPI或7-AAD,终浓度分别为PI(5 ?g/ml)、DAPI(500-1000 ng/ml)、7-AAD(2.5 ?M)

3. 加入上述染料后,尽快上机,一般不要超过5分钟(有些厂家说明书写着10分钟,可能与浓度有关,可按照说明书操作)。

PI检测通道:使用488 nm激发,用610/20 BP收集

DAPI检测通道:最好用355nm激发,用440/40BP收集;也可以用405nm激发,450/50BP收集

7-AAD检测通道:用488nm激发,用670/14BP收集

下图是用PI检测细胞死活的结果图:

1、细胞死亡:细胞死亡作为生物体的一种常见现象,在动物细胞中有三种方式:凋亡(apoptosis),自噬(autophagy)和坏死(necrosis)。前两种类型属于细胞程序性死亡(programmed?cell?death,PCD)。细胞坏死是细胞在遭受极度刺激时引起的细胞死亡,以细胞质膜的破裂为特征,造成内含物的炎性泄露,是一种非正常死亡。细胞的PCD是细胞的一种“主动性”死亡行为,从形态上和功能上都与细胞坏死有很大的不同。

2、植物中细胞程序性死亡(PCD):目前可依据液泡膜破裂后,是否在细胞质中发生快速降解将PCD分为两个大类。第一类为自溶性(autolytic)PCD,与液泡中的水解酶的释放有关,在液泡破裂后,导致细胞质的快速清除。第二种为非自溶PCD,(non-autolytic),即液泡膜破裂但是没有出现快速的细胞质的清除。目前鉴定细胞的PCD类型,还是以细胞形态学为主。

3、动植物细胞凋亡标准:动物:凋亡:凋亡小体,或者在细胞表面的水泡,感染病原体后在其他细胞中的降解。自噬:自噬小体,自溶酶体,和小的促进细胞溶解的液泡数目的增加坏死:没有上面的定义的标准。植物:自溶:植物膜破裂之后对细胞质的快速清理。非自溶:没有对细胞质的快速清理。其他:染色质浓缩细胞核破裂自我标记信号自食信号细胞膨胀,细胞器膨胀,质膜破裂染色质浓缩。液泡体积增加(细胞质体积减小)需要Ca2+的内流,细胞质皱缩,细胞器膨胀,小泡增多但体积不增加。

 
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