western

一。免疫印迹法

?免疫印迹法（immunoblotting?test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme?linked?immunoelectrotransfer?blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen?blot相类似，亦被称为Western?blot。免疫印迹（western?blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分

离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已

经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min

转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印

有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶

标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP

底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰

可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了

SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅

广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此

法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体

及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判

断有无针对病毒的特异性抗体。

Westernblot?实验步骤及注意事项?

?

一.实验步骤?

?

1.?组织块称重?

?

2.?利用液氮、研钵粉碎组织块?

?

3.?加入RIPA缓冲液（每克组织3?ml?RIPA），PMSF（每克组织30μl，10?mg/ml?PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃?

?

4.?加入PMSF（每克组织30μl，10?mg/ml?PMSF），冰上孵育30分钟?

?

5.?移入离心管4℃?约20,000?g（约15,000转）15分钟?

?

6.?上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存?

?

7.?进行Bradford比色法测定蛋白质浓度?

?

8.?取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液?

?

9.?沸水浴中3分钟?

?

10.?上样?

?

11.?电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）?

?

12.?电转膜仪转膜（100mA?40分钟）?

?

13.?膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色?

?

14.?Westernblot?试剂盒显色?

?

15.?分析比较记录?

?

western?blot的实验步骤及注意事项的资料?

?

1.?把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。?

1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。?

2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。?

3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。?

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。?

5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。?

6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。?

?

2.?将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。?

?

3.?用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。?

?

4.?膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。?

?

5.?室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。?

?

6.?用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。?

?

7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。?

?

8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）?

9．用总体积300ml?PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。?

?

10.?将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升?NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。?

?

11．按步骤9洗涤。?

?

12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升?NGS），于室温下摇动。?

注意事项：?

western?blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western?blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western?blot。实验中取胶和膜需带手套。?

?

Western可以参考如下步骤进行操作。?

?

1.收集蛋白样品(Protein?sample?preparation)?

可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚?

细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒?

进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。?

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要?

采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生?

产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。?

?

2.?电泳(Electrophoresis)?

?

(1)?SDS-PAGE凝胶配制?

SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配?

胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。?

?

(2)?样品处理?

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋?

白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。?

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。?

?

?

?

(3)?上样与电泳?

冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。?

为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。?

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置?

或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，?

也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在?

100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。?

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适?

当分离后即可停止电泳。?

?

3.?转膜(Transfer)?

我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子?

夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。?

通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过?

夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，?

需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。?

在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。?

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春?

红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋?

白的残留情况。?

?

4.?封闭(Blocking)?

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步?

骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。?

用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在?

4℃?封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋?

白膜。?

?

5.?一抗孵育(Primary?antibody?incubation)?

参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。?

用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果?

不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。?

回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤?

3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。?

?

6.?二抗孵育(Secondary?antibody?inucubation)?

参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。?

用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。?

回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤?

3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。?

?

7.?蛋白检测(Detection?of?proteins)?

参考相关说明书，使用BeyoECL,?Western?荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。?

洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。?

?

8.?膜的重复利用(Membrane?recovery)?

如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

夹丝玻璃厂哪个好

地更新与完善。医用相机(或打印机)作为CT、CR、MR、DSA等先进医疗设备的输出设备，已基本取代了多幅相机，成为大多数医院的最佳选择『l_。本文着重介绍目前使用较多的干式、湿式激光相机的原理及维护

1 激光相机一般工作原理

激光相机的光源为激光束，激光束通过发散透镜系统投射到一个转动的多棱镜再折射，折射后的激光束通过聚焦透镜系统打印在胶片上。

激光束的强度可以由调节器调整，调节器受数字信号控制。成像装置把图像的像素单元值以数字的方式输入到激光打印机的存储器中，直接控制每一个像素单元的激光曝光强度。如果计算机按顺序输出激光束胶片位置的同期信息，则可以将顺序不同的电信号作为平面影像由激光照到胶片上。曝光后，胶片再经显影、定影处理，从而获得照片图像。

2 激光相机工作过程

当激光相机接通电源后，机器控制系统(MCS)对中央处理器(CPU)和传递系统进行自检。自检完成后，MCS发送硬件

复位指令到图像管理系统(／MS)，使IMS初始化。上述程序工作的同时，胶片干燥系统加热；如果是湿式相机，红外线加热器对显、定影液加热。~iReady灯亮时，说明激光相机已准备完毕，可以使用。操作者用键盘存储按钮存储每一幅图像，并向多路器(MMV)送出指令和图像数据。MMV接到指令后，由CPU控制输出编排器，根据操作者的设置，将激光相机图像编排成行并放大．然后，将图像数据从数字转化成模拟信号。当激光发生器工作正常后，图像模拟信号控制激光调制器，用以改变激光束的明暗度，通过一系列透镜聚焦和反光镜(约10个)把激光束传送到胶片上。在此过程中，利用光敏探测器从一个固定光束分流镜中连续不断地采集信号，反馈到激光发生器，使源激光束保持稳定不变。用旋转光束分流镜控制光束传送到胶片上使其感光，这种方式称为X轴快速扫描。照相机柜内的鼓是以固定速度传送胶片的，这种方式称为Y轴慢速扫描。这样，相机以6o0行／秒图像数据传输速度准确地复制全部图像。

胶片由供片的储存暗盒(可容纳100张激光片)自动提供，在引导轴传送下装载在专用的打印滚筒上，滚筒随即转到打印位置。此时，激光束按照计算机及矩阵指令，把图像像素单元PIX—EL灰度值的数字化密度传人激光相机存储器中，直接控制每一个像素单元的激光曝光时间进行强弱改变。激光束通过多棱镜的旋转进行扫描打印。在全部曝光过程中，滚筒和激光束精确地同步运动，根据主机成像装置编排的版面和图像尺寸，选择多幅照片的图像联合和排列，用操作盘来完成，进行打印。一幅图像的矩阵像素为4kx5k，待全部图像打印完，胶片即被传输到接片盒内或传输到自显机内，自动冲洗。

3 激光相机组成结构

3．1 湿式激光相机

湿式激光相机的结构主要由6部分组成：开关电源、影像控制系统(IMS)、抓片机构控制系统(PCB)、激光打印控制系统、胶片传动控制系统(MCS)、自动冲洗单元。各部分主要功能如下：

(1)开关电源：为激光相机各工作单元提供相适应的工作电源。

(2)影像控制系统：负责把主机的图像信号进行整理，根据需要进行分格排版；同时，可对图像对比度、密度进行调节等。由计算机控制的影像控制系统是激光相机的核心。相机的图像信号传递到激光相机后，要经过一系列的处理修正，调整图像的尺寸、大小、版面。激光头依据排版后的图像信号输出强弱不同的激光，从而完成对胶片的扫描过程。激光相机的处理能力决定了相机的图像质量、适应能力和应用范围。

(3)抓片机构控制系统：负责将需要扫描的胶片抓起，送人激光扫描区。

(4)激光打印控制系统：湿式激光打印控制系统由激光扫描和胶片传送2部分组成。排版完成的图像信号，通过控制电路转变为激光扫描所需的光信号。激光束经校准后按“行式扫描”(从左至右)在胶片上形成图像信号的潜影。胶片传递系统在伺服系统控制的高精度电机带动下，保证在激光器进行扫描时，带动胶片在Y轴方向匀速的向前移动通过扫描区，从而完成整张胶片的扫描(打印)过程。

(5)胶片传动控制系统：负责胶片的整个传送过程。

(6)自动冲洗单位：激光相机和自动洗片机连接在一起，使打印形成潜影后的胶片不进入收片盒， 而直接进入洗片机进行冲洗。

3．2 干式激光相机

干式激光相机的结构主要由6部分组成：开关电源、影像控制系统(IMS)、抓片机构控制系统(PCB)、激光打印控制系统、胶片传动控制系统(MCS)、胶片显影旋转加热系统。各部分主要功能如下：

(1)开关电源、影像控制系统、抓片机构控制系统、胶片传递控制系统这4部分功能与湿式激光相机大体相同。

(2)激光打印控制系统：与湿式激光相机不同，干式激光相机在激光打印过程中，胶片始终处于静止状态，激光束在胶片X轴和Y轴方向上的扫描全由激光头上所附带的控制机构完成。厂家或型号不同的激光相机，其扫描方式也不同。

(3)胶片显影旋转加热系统：该系统将激光扫描后的胶片进行加热而使其显影，从而完成湿式激光相机中自动洗片机的显影、定影、水洗、烘干等工作。

4 激光相机的维护与保养

无论是干式还是湿式激光相机，其使用说明书中均提供了维护保养的说明与方法，应严格按照说明书的要求仔细操作。如果相机出现故障，可按照故障提示进行一般的处理；对于较复杂的故障．建议找厂家工程技术人员维修。

4．1 湿式激光相机

(1)机房内湿度宜保持在2O℃左右，并保持适当的通风和干燥。因为，药液挥发出的酸碱气体和室内潮湿的空气对机器的电路与元器件有一定的锈蚀作用，易引起机器工作不良或发生故障。

(2)根据洗片量和药液的衰减程度定期更换药液，每次更换药液时应彻底清洗显影、定影及水洗槽，清除各处的结晶物。认真清洗、擦拭各液面探头，使其保持良好的工作状态。认真仔细地刷洗各洗片滚轴，注意避免损伤齿轮和滚轴表面。更换药液或清洗时应使用专用挡板挡在显影槽上， 以免药液沿胶片进口溅入打印机。每次更 换药液时可手工将显、定影槽加满药液，以防探头出现工作不良时烧毁热棒。水洗槽的进水用过滤棒过滤，防止水中的杂质污染胶片而影响照片的图像质量。药液更换完毕，开机观察显示面板信息，并注意各部分动作的声音是否正常。机器自检加热完毕并显示“on line”后，方可打印胶片。

4．2 干式激光相机

4．2．1 干式激光相机维护的安全指导

(1)电气或机器故障只能由有经验的人员进行维修；(2)切勿替换或拆卸集成的安全装置；(3)切勿遮盖通风口；(4)不要给打印机加润滑油；(5)进行任何维护工作前，务必关闭设备并从插座中拔下电源线(未关闭电源时，可以清除胶片卡塞或清洁打印机热敏头)。

4．2．2 干式激光相机的表面清洁

(1)关闭设备；(2)从插座上拔下电源插头；(3)用干净、柔软的湿布擦拭表面。如果需要，可使用适量的肥皂水或洗洁剂清洗，但切勿使用氨基清洁剂。清洁时要小心谨慎，切勿使任何液体进入电源线端El或流人相机内部；(4)插上电源后开启

设备。

4-2．3 激光头的清洁

(1)关闭电源；(2)按照相机说明书打开设备；(3)用浸有少量乙醇不起毛的布，沿同一个方向轻轻地擦拭，不要将布抬起，切勿对激光头施加任何压力，以免造成损坏；(4)安装好设备，开启电源。

4．2．4 激光相机卡片

激光相机发生卡片时，一般有故障提示：Film Jam。造成卡片的原因很多 。如：胶片输入盘无法送片、传动轴轴问摩擦力不匹配、传感器失灵、突然停电等。因此，需要认真分析，准确判断卡片位置，对症下药，清除被卡的胶片。

参考文献

1] 孟伟．AGFA激光相机常见故障及维修[JJ．医疗卫生装备，2005，26(7)：78．

2] 潘国宾．柯达l9O医用激光相机卡片故障检修[JJ．医疗卫生装备，2005，26(10)：86．

?人们经常见到了玻璃都是透明的，但是有一些是带花纹的，那是其中掺杂了一点儿别的物质，这也是人们常说的夹丝玻璃。现在普通的玻璃使用范围明显没有夹丝玻璃使用的范围广，这是因为夹丝玻璃更具美观性，它的制作工艺自然也会复杂一些，所以对它的厂家也会有更高的要求，关于玻璃的制作厂家有很多，这里小编就为大家介绍一下夹丝玻璃厂哪个好。

??夹丝玻璃厂哪个好

青岛晶宇玻璃装饰工程有限公司

青岛晶宇玻璃装饰工程有限公司是一家集玻璃深加工、开发、生产、销售及工程施工于一体的大型综合性装饰玻璃公司。公司现拥有干法夹胶机、蒙砂生产线、烤漆生产线、玻璃彩色打印机、洗片机、电脑刻绘机及各种玻璃磨边机等深加工设备。主要从事中高端装饰玻璃、艺术玻璃的加工与销售。并有多项专利产品，深受设计师的喜爱，并广泛应用于酒店，别墅等高端装饰场所。

杭州洛卡创意玻璃有限公司

成立于2008年，是继承洛卡装饰风格的新艺术玻璃生产实体企业，工厂建在杭州萧山区，主要从事艺术玻璃深加工设计，销售，安装服务。公司经过多年的发展，通过与客户建立良好的交流沟通及合作，主要客户是星级酒店,宾馆,夜总会,会所，咖啡厅，大型浴场，酒吧。公司以诚信为本、质量保证、服务至上的基本经营理念，期待与大家携手共进，共同发展。

广东明安防火玻璃科技有限公司

广东明安防火玻璃科技有限公司是中国防火玻璃行业的领军企业，公司成立于1999年初，专注于研发和制造防火玻璃及其相关门窗制品，现建有建筑面积为25000平方的两大生产厂区。公司属下鹤山市明安防火玻璃制品有限公司为专责国内市场的核心生产企业。

上海鹿河玻璃装饰有限公司

上海鹿河玻璃装饰有限公司位于上海市青浦区华新镇华纪路233号。子公司杭州聚焦玻璃科技有限公司，我公司是中国唯一代理销售旭硝子产透明夹丝玻璃、防火夹丝玻璃、AGC特种玻璃、日本旭硝子夹丝玻璃，该玻璃具有防火.防爆等功效，用于地铁，商场消防专用防火挡烟垂壁。表面与普通浮法一样平整透明，有方格，凌形，平行格，厚度6.8MM,10MM，。全国唯一销售大板面3820*2540原片;非两片玻璃夹胶做成。可再加工成热弯，烤漆，夹胶等工艺品。具有防火、防爆证书。

?夹丝玻璃厂有很多，每一家的玻璃样式也不会一样，如果想要刚好符合自己要求的，就要提供相应的样式图案才可以。夹丝玻璃比起普通的玻璃还有许多的优点，特别是防碎，玻璃很容易破碎，夹丝玻璃相对而言就更加坚固一些，无论从外观方面，还是性能上来看，它都是人们使用的不二选择，因此，使用夹丝玻璃的人数在不断的增加，想要选择一个好的夹丝玻璃厂，就要我们多多了解各个厂家。